基础研究 | 维生素K3对光老化HaCaT细胞保护作用的研究

编者按：

        光老化被认为是紫外线辐射损伤在皮肤老化基础上的叠加，作为一种退变过程而引起人们的广泛关注，尤其是A型长波紫外线(UVA)，UVA过度辐照将导致皮肤红斑生成、ROS异常表达、MMPs、COX-2等生成并导致炎症发生，推动光老化。自噬与衰老密切相关，具有许多共同的特征，在衰老机制的研究中发现，细胞自噬能够延缓器官功能退化，这表明两者在细胞中可能发挥相似的功能和作用。随着研究的进展，许多证据提示：自噬，同样可能与有机生物体内最大的器官-皮肤组织的老化密切相关。研究证实，自噬可以通过清除UV辐照细胞内受损的蛋白质和脂质，修复DNA，帮助细胞恢复代谢稳态，为光老化受损的皮肤提供保护作用。适度的自噬有助于抑制紫外线损伤皮肤角质形成细胞，维持正常的细胞自噬水平有助于抵抗UVA所致的光老化。维生素K3(Vit K3)是一种合成的类似Vit K的物质，作为维生素原在体内转化为活性形式。最近一些研究表明，Vit K3具有诱导细胞自噬的功能。

        徐州医科大学附属医院皮肤科魏志平医生与徐州医科大学研究生院韩伊杨医生团队， 以人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）作为体外UVA辐照光老化细胞的模型，旨在初步探索Vit K3对UVA辐照下角质形成细胞的生物学作用，以期进一步为光老化治疗的研究提供理论依据和新的思路。

1 方  法

试剂与仪器：

        维生素K3（美国Sigma公司）；DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；CCK-8试剂盒（日本同仁有限公司）；倒置荧光显微镜（美国赛默飞公司），兔抗人β-actin单克隆抗体（Abcam公司）；兔抗人COX2单克隆抗体（Abcam公司）；兔抗人MMP1单克隆抗体（Abcam公司）；兔抗人LC3B单克隆抗体（Abcam公司）；手提UVA紫外灯（徐州科诺公司）。Vit K3以二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为100mM的母液（DMSO浓度≤2‰）保存，使用时用DMEM培养基稀释至工作浓度，现配现用。

 细胞培养及实验分组：

        HaCaT细胞株（上海复祥生物科技有限公司）。将处于对数生长期的HaCaT细胞消化、计数。以8×103 个/孔将细胞接种至96孔板，每组6个复孔，于37℃、5%CO2培养箱过夜。运用CCK8法测出Vit K3对细胞的最大无毒浓度，在此浓度之下预实验，最终分为5组，即阴性组（只含培养液并进行假照光）、单纯光照组、0.125μM、0.25μM和0.5μM Vit K3药物干预组。药物干预组于照光前Vit K3预处理24h，照光后继续孵育24h，阴性组及单纯光照组则加入无血清培养基孵育相同时间。

 构建UVA光老化HaCaT细胞模型：

        96孔板细胞贴壁后吸弃原培养基，用PBS清洗3次，每孔加入35μl冷PBS覆盖细胞，用遮光板遮住不需要照射的细胞组，进行UVA照光。紫外辐照仪测得本实验持有的UVA紫外灯灯管的光照强度平均约为5.02mW/cm2 。根据公式：光照剂量（mJ/cm2 ）=光照强度（mW/cm2 ）×光照时间（s）计算。为了达到分组所需的辐照剂量（5J/cm2 、10J/cm2 、15J/cm2 ），细胞需要分别暴露于UVA辐照下16.6min、33.2min、49.8min。

        CCK-8法检测Vit K3对HaCaT细胞活性的影响：终止培养后，每孔避光加入CCK-8试剂10μl（原96孔板每孔加入试剂量为90μl），置于培养箱中孵育2h，然后将96孔板移至酶标仪中，在450nm波长处测定每孔的吸光度（A值），实验重复3次。计算细胞存活率（%）=（给药组A值-空白孔A值）/（阴性组A值-空白孔A值）×100%。

        DCFH-DA荧光探针检测HaCaT细胞内ROS的水平：

        培养结束后，DCFH-DA母液用无酚红培养基稀释避光孵育细胞30min，流式组消化收集细胞上机检测，在488nm激发波长和530nm发射波长下的荧光强度，每个样品收集10 000个HaCaT细胞，保存并分析数据。拍照组，在倒置荧光显微镜下观察并拍摄图片。

         Western blot法检测Vit K3对HaCaT细胞中蛋白表达情况：

        收集细胞，提取蛋白，将各组蛋白原液稀释到同一浓度，然后用上样缓冲液配平蛋白样本，95℃孵育10min，制备好的蛋白样品使用聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，电转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2h，一抗孵育，然后TBST洗膜，洗3次，每次5min，二抗孵育后，滴上ECL发光液，使用化学发光仪进行显色。

2 结  果

        与单纯光照组相比，维生素K3能够促进光老化HaCaT细胞的体外增殖，且呈浓度依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）；药物干预组HaCaT细胞的ROS含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；细胞 内MMP1、COX2蛋白表达降低，LC3B表达增，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 结  论

        维生素K3能够对UVA辐照HaCaT细胞提供光保护作用，其机制可能与促进细胞自噬有关。