【综述】干细胞来源的外泌体对骨形成作用的研究进展

摘 要

        临床上对于骨形成有着较大的需求，如骨质疏松，骨折，颅骨缺损等。虽然已经出现了生物材料和自体或异体骨移植等治疗途径，但仍存在一些应用限制及并发症。而近几年，细胞外囊泡特别是外泌体的发现，为骨形成提供了新的思路。特别是源自干细胞的外泌体已显示出促进成骨的巨大潜力。本文主要讨论了外泌体的基本概念，其主要分离和鉴定技术以及干细胞来源的外泌体在骨形成作用中研究进展和潜在临床应用。

李云飞，施洁珺，周 益

1.浙江大学医学院 附属口腔医院·浙江大学口腔医学院·浙江省口腔疾病临床医学研究中心·浙江省口腔生物医学研究重点实验室·浙江大学癌症研究院

本文发表于《中国医疗美容》2022年第3期

DOI：10.19593/j.issn.2095-0721.2022.03.017

1   外泌体的概念

        大多数真核细胞都会分泌与细胞间通讯相关的细胞外囊泡。这些高度异质的膜封闭结构可能对邻近和远处的细胞都有影响。细胞外囊泡可分为三个类型，分别是凋亡小体，微泡和外泌体[11, 12]。

        细胞外囊泡根据其大小进行分类，其中直径约为30-150nm的细胞外囊泡群体被称为“外泌体”[13,14]。它们能在大多数体液中被提取（例如：血液，乳汁，唾液，精液，尿液），并且几乎能从所有哺乳动物细胞类型中纯化获得（例如：内皮细胞，神经元细胞，肌肉细胞，干细胞等）[11, 15, 16]。

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2 外泌体的分离和鉴定

        其中超速离心是用于外泌体提取的最广泛使用的的分离技术，被认为是外泌体提取的“金标准”[24]。超速离心根据其大小和密度差异将外泌体与其他组分分离。包括：1、低速旋转（300–500 RCF）以除去细胞和凋亡碎片;2、高速旋转（1000–20000 RCF）以消除较大的囊泡; 3、超速离心（100000–150000 RCF）分离外泌体。超速离心是一种基本不改变外泌体性质的纯物理提取方法，但是这种分离技术存在需要的仪器较为精密复杂、耗时较长、提取量有限等缺点[25, 26]。为了提高获得外泌体纯度并减少离心时间，可以在最后一步后进行额外的纯化，例如蔗糖梯度离心[27]。

        聚合物沉淀是一种有效、可靠，能够替代耗时较多的超速离心的方法[28]。通过调节外泌体的溶解度和分布，它们可以从体液中沉淀出来。目前，几种外泌体提取试剂盒（例如ExoQuick试剂盒，总外泌体分离试剂盒等）已被研发，其使用不含水的聚合物（例如聚乙二醇）结合水分子，使溶液中不易溶解外泌体颗粒沉淀从而以较少的时间获得可观量的外泌体，能够做到简单可靠地提取外泌体[28,29]。

        在提取到外泌体之后，需要对其做鉴定，通常可以基于囊泡数量，表面生物标志物，大小，电势等，通过蛋白质印迹，PCR等手段来鉴定提取的外泌体，同时透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）和纳米粒子跟踪分析（NTA）也是外泌体鉴定手段之一[30]。但是当使用TEM和SEM检测外泌体时，对样品的脱水可能会导致外泌体的形态变化，是其应用的主要限制[31]。

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3 干细胞来源的外泌体在骨形成方面的作用

        在过去的几年中，外泌体在骨组织修复和再生领域受到了广泛的关注，许多研究表明，与骨相关的细胞，如破骨细胞，成骨细胞，骨细胞和骨髓间充质干细胞，也释放外泌体[32]。通过将生物活性分子转移至靶细胞，有利于破骨细胞和成骨细胞的分化。外泌体特别是干细胞来源的外泌体单独或结合载体使用，可有效恢复或促进生物体骨形成能力[33, 34]。

        生物材料与外泌体的结合能够更好的发挥外泌体的促进骨形成作用，与纯磷酸三钙支架相比，含有人诱导多能干细胞的间充质干细胞（hiPS-MSC）来源的外泌体的磷酸三钙支架具有更强的成骨作用，其可能通过激活PI3K / Akt信号通路来增强hBMSCs的增殖、迁移和成骨分化[41]。

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